Apr 30, 2012 - Uncategorized    Comments Off

Metode dan Proses Pembuatan DNA Fingerprinting

Teknik PCR analisis

Polymerase chain reaction (PCR) adalah suatu proses pembentukancetakan DNA secara berulang kali dengan menggunakan prosedurdan waktu yang tertentu. PCR menggunakan teknik amplifikasi(perbanyakan) secara spesifik pada suatu segmen DNA secara invitro dengan menggunakan DNA polimerase, cetakan (template),DNA genom, dan primer oligonukleotida.

Prinsip dasar dari teknik PCR tersebut merupakan adanya enzimDNA polimerase yang digunakan untuk membuat cetakan darisegmen DNA yang diinginkan.

Polymerase Chain Reaction

Berikut adalah tiga tahap bekerjanya PCR  (Polimerase Chain Reaction) dlm satu siklus:

1. Tahap peleburan/melting/denaturasi PCR  (Polimerase Chain Reaction). Tahap ini b’langsung pd suhu tinggi, 94–96°C, ikatan hidrogen DNA t’putus (denaturasi) & DNA menjadi berberkas tunggal. Biasanya pd tahap awal PCR  (Polimerase Chain Reaction), tahap ini dilakukan agak lama (sampai 5 menit) utk memastikan semua berkas DNA terpisah. Pemisahan ini menyebabkan DNA tdk stabil & siap menjadi templat (“patokan”) bagi primer. Durasi tahap ini 1–2 menit.

2. Tahap penempelan/annealing PCR  (Polimerase Chain Reaction). Primer menempel pd bagian DNA templat yg komplementer urutan basanya. Ini dilakukan pd suhu antara 45–60°C. Penempelan ini bersifat spesifik. Suhu yg tdk tepat menyebabkan tdk terjadinya penempelan atau primer menempel di sembarang tempat. Durasi tahap ini 1–2 menit.

3. Tahap pemanjangan/elongasi PCR  (Polimerase Chain Reaction). Suhu untuk proses ini tergantung dari jenis DNA-polimerase (P pada gambar) yg dipakai. Dengan Taq-polimerase, proses ini biasanya dilakukan pada suhu 76°C. Durasi tahap ini biasanya 1 menit.

Alat Polymerase Chain Reaction

Teknik STR (Short Tandem Repeats ) Analisis

STR merupakan polimorfisme DNA yang terjadi karena adanya 2 atau lebihnukleotida yang berulang. Pola pengulangannya adalah terdiri dari 2-10 bp dan terjadipada daerah intron dari DNA. Dengan menganalisa loci dari STR dan menghitungberapa banyak perulangan dari sekuen STR yang terjadi di setiap locus, maka dapat terbaca profil genetik yang unik dari setiap individu. Analisa dengan STR memerlukan teknik PCR dan elektroforesis gel agarosa. Dengan PCR daerah polimorfik dari DNAdiamplifikasi dan kemudian fragmen STR dipisahkan dengan elektroforesis agarosa sehingga jumlah perulangan yang terjadi dapat dihitung dengan membandingkan perbedaan ukuran dengan alelic ladder. Analisa dengan STR ini tidak dapat dilakukan apabila 2 individu merupakan kembar monozigot.

Teknik STR

Teknik AMP (Amplified Fragment Length Polymorphism)  FLP

DNA profilling dengan menggunakan teknik AmpFLP memiliki beberapakeunggulan, yaitu lebih cepat daripada analisa dengan RFLP dan biaya yangdibutuhkan lebih murah. Teknik ini berdasarkan pada polimorfisme VNTR untukmembedakan alel yang berbeda. Teknik ini menggunakan PCR untuk mengamplifikasidaerah VNTR dan kemudian hasil amplifikasi dipisahkan dengan gel poliakrilamid dandiwarnai dengan teknik silver stained . Salah satu locus yang sering digunakan dlamteknik ini adalah locus D1S80.

Teknik AmpFLP

DNA family relationship analysis

Dengan menggunakan teknologi PCR, analisis DNA secara luas dapat digunakan untuk menentukan hubungan keluarga seperti hubungan orangtua dan anak, saudara, dan hubungan kekerabatan lainnya.

Selama pembuahan, sel sperma ayah dan sel telur ibu, yang masing-masing mengandung setengah jumlah DNA yang ditemukan dalam sel tubuh, bertemu dan bergabung membentuk zigot. Zigot berisi satu set lengkap molekul DNA kombinasi dari kedua orang tuanya. Zigot ini membelah lalu menjadi embrio dan akhirnya menjadi janin.

Pada setiap tahap perkembangan, semua sel yang membentuk tubuh berisi DNA yang sama yaitu setengah dari ayah dan setengah dari ibu. Fakta ini memungkinkan pengujian hubungan keluarga menggunakan semua jenis sampel seperti sel darah atau jenis sampel lainnya.

Kebanyakan  DNA berisi informasi untuk fungsi tertentu, tetapi ada beberapa DNA yang disebut junk DNA, yang saat ini digunakan untuk identifikasi pada manusia. Pada beberapa lokasi khusus (disebut lokus) dalam junk DNA, pola warisan yang diprediksi ditemukan berguna dalam menentukan hubungan biologis. Lokasi ini berisi DNA markers spesifik yang digunakan oleh para ilmuwan untuk mengidentifikasi individu. Dalam tes paternitas DNA rutin, penanda yang digunakan adalah Short Tandem Repeats (STR), potongan pendek DNA yang terjadi dalam pola berulang yang sangat berbeda antar individu.

DNA setiap orang memiliki dua salinan dari markers  ini, satu warisan dari ayah dan satu dari ibu. Dalam suatu populasi, markers di lokasi DNA setiap orang dapat berbeda panjang dan kadang-kadang urutannya, tergantung pada markers yang diwarisi dari orang tua.

Kombinasi ukuran marker ditemukan pada setiap orang sehingga membentuk profil genetik yang unik. Ketika menentukan hubungan antara dua individu, profil genetik mereka dibandingkan untuk melihat apakah mereka memiliki pola warisan yang sama pada tingkat statistik yang meyakinkan.

Berikut ini adalah contoh laporan tes DNA dari laboratorium Universal Genetics yang menandakan bagaimana keterkaitan antara orang tua dan anak-anak, teridentifikasi dari special markers yang dimiliki:

DNA Marker

Mother

Child

Alleged father

D21S11

28, 30

28, 31 29, 31
D7S820 9, 10 10, 11 11, 12
TH01 14, 15 14, 16 15, 16
D13S317 7, 8 7, 9 8, 9
D19S433 14, 16.2 14, 15 15, 17

Hasilnya menunjukkan bahwa DNA anak dan ayah dugaan sesuai di lima marker. Hasil uji yang lengkap menunjukkan korelasi ini pada 16 marker antara anak dan orang diuji untuk menarik kesimpulan apakah orang itu adalah ayah biologis dari anak tersebut.

Secara ilmiah, setiap marker diberi indeks  Paternity Index (PI), yang merupakan ukuran statistik dari seberapa kuat kecocokan pada marker tertentu yang menunjukkan hubungan kekerabatan. PI dari setiap marker disilangkan satu sama lain untuk menghasilkan Combined Paternity Index (CPI), yang menunjukkan probabilitas keseluruhan dari seorang individu menjadi ayah biologis dari anak diuji relatif untuk setiap orang secara acak dari seluruh penduduk dari ras yang sama. CPI kemudian diubah menjadi Probability of Paternity yang menunjukkan tingkat keterkaitan antara ayah dugaan dan anak.

Laporan tersebut menunjukkan profil genetik dari setiap orang diuji. Jika ada marker yang sama di antara individu-individu yang diuji, kemungkinan hubungan biologis dihitung untuk menentukan seberapa besar kemungkinan individu-individu yang diuji memiliki marker yang sama karena hubungan darah.

Y-chromosome analysis

Inovasi terbaru telah disertakan untuk analisis DNA yaitu creation of primers targeting polymorphic regions pada kromosom Y-(Y-STR), yang memungkinkan resolusi sampel DNA campuran dari pria dan wanita dan/atau kasus di mana differential extraction tidak mungkin. Y-kromosom dari ayah diwariskan, jadi analisis Y-STR dapat membantu dalam identifikasi hubungan darah anak laki-laki dengan orang yang diduga ayah anak tersebut.

Mitochondrial analysis

Untuk sampel yang mudah terdegradasi, kadang-kadang mustahil untuk mendapatkan profil lengkap dari 13 STR CODIS. Dalam situasi ini, DNA mitokondria (mtDNA) dapat digunakan nuntuk analisis kecocokan DNA. Karena mtDNA diwariskan oleh ibu, kerabat ibu dapat digunakan sebagai referensi kecocokan. Perbedaan dari dua atau lebih nukleotida umumnya dianggap sebagai sebuah pengecualian. Heteroplasmi dan poli-C perbedaan dapat menghilangkan perbandingan urutan lurus, sehingga keahlian pihak analis sangat diperlukan. mtDNA ini berguna dalam menentukan identitas dengan jelas. mtDNA dapat diperoleh dari bahan seperti rambut dan tulang / gigi.

Mitochondrial Analysis

Comments are closed.